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作者：Alan Dove /文 李楠/译 来源： 发布时间：2018-11-13 17:9:39
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聚焦循环系统
肿瘤活检是医学研究中最麻烦、最危险、最昂贵的一类检查，研究人员数十年来一直在努力改进它们。虽然日趋灵敏的检测方法使医生能够从某些实体肿瘤中提取更小的样本，但肿瘤学专家长期以来一直梦想着开发一种可以完全避免传统方式的活检手段。所以科研人员将目光投向了液体活检，这是一种利用血液或其他容易获取的体液（如唾液）中的生物标记物检测和分析实体肿瘤的检测方法。
肿瘤经常将细胞和亚细胞成分释放到血液中，但是通常它们很难被发现。即使在癌症晚期，健康细胞和游离生物分子在血液中的浓度仍然比大多数肿瘤标志物高好几个数量级。研究人员正在使用新型的纯化和分析技术，将几类的液体活检方法推向临床。
该领域内主要有三种检测手段：检测游离核酸，分离完整的循环肿瘤细胞，以及从肿瘤中识别细胞外囊泡。三种方法瑕瑜互见。通过一些已经批准用于临床的液体活检和临床试验结果，该领域的专家们一致认为，这些方法的应用将带来重大突破。
小反应，大作用
在这三种方法中，基于核酸的液体活检在早期处于核心地位。马萨诸塞州波士顿丹娜—法伯癌症研究所(Dana-Farber Cancer Institute)贝尔佛应用癌症研究中心的转化研究实验室负责人Cloud Paweletz认为将来基于无细胞的DNA液体活检方法接受程度和应用范围会变得广泛，主要是因为它在临床中的应用难度很低，易于掌握。他解释说，基于DNA的液体活检通常使用标准的采血管即可，而且基于聚合酶链反应（PCR）的活检对临床实验室人员来说特别容易理解，实施起来很容易。
Paweletz和他的同事们正在开发一种基于PCR的检测方法，并将其应用于肺癌耐药性突变的检验。这项测试在标准血液样本中进行，仅需要两天时间，可以识别出影响40%肺癌患者的三种突变中的任何一种。该团队正在积累临床活检经验，以建立肿瘤学检测方法。
Geoff Oxnard是波士顿丹娜-法伯癌症研究所和哈佛医学院的助理教授，也是Paweletz的合作者之一。他评论道：“上周我遇到一个病人，因为转移性肺癌住院，她正是那种可能有上皮生长因子受体EGFR突变的患者，但我无法获取足够的组织样品来进行研究。”Oxnard补充说，通过目前丹娜—法伯癌症研究所开发的液体活检方法，他能够确定这位患者确实有相应的突变，这将使她成为针对该突变的药物试验的候选受试者。
Paweletz说：“临床需要推动这项技术的发展，而这项技术的应用也将为临床诊治提供新的能力”。除了基于聚合酶链式反应的检测，他的团队还在设计其他液体活检方法，如利用二代测序技术（NGS）来识别更广泛的肿瘤和突变类型。
对于以PCR为基础的检测，包括Paweletz和Oxnard在内的许多液体活检开发人员发现，利用常规的定量聚合酶链式反应（qPCR）技术是存在缺陷的。即使在对样本先进行纯化，在待测体液中来自健康细胞的核酸也会多于来自肿瘤的核酸。大量qPCR样本中的早期偏差将在随后的周期中被放大，淹没了肿瘤的信号。加州赫拉克勒斯伯乐（Bio-Rad）的体外诊断部研发经理Dawne Shelton说：“无细胞液体活检的问题在于，野生型DNA的量可能非常非常高，因此，要避免真正罕见的信号被野生型淹没……这是关键”。
为了解决这一问题，研究人员采用了一种叫做数字PCR的技术，将样本中的游离DNA分离到只包含单个模板的许多微反应中。例如，在Bio-Rad的液滴数字PCR系统中，扩增步骤之前，喷雾机将一个样品分割成成千上万个纳米尺度的微液滴。PCR反应发生在单个液滴内部，然后机器利用荧光标记的信号进行分选，以检测目标序列。
与NGS相比，数字PCR相对简单、价格低廉，对于刚刚开始进行液体活检技术研究的人来说，这是一个不二选择。尽管如此，Shelton警告说，这项技术需要仔细考虑生物学家可能很少关注的问题。她说：“我们所做的大多数液体活检都是针对微量的样品。因此，使用不合适的样品提取方式或未优化的试剂盒可能导致大量信号的遗失。”她补充说，这个微量同时意味着研究人员还必须使用稳定的统计学方法来区分有意义的肿瘤信号、随机突变和检测误差。
肿瘤释放的小东西
除了继续数据分析工作，研究液体活检的研究人员还需要仔细考虑他们的对照样品。马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司临床测序和肿瘤学研发部主任Kelli Bramlett说：“很难让人造样本表现得像真正的无细胞核酸一样，所以这是一个相当大的挑战。”
Bramlett的团队致力于人类血液中DNA和RNA的液体活检技术的研发。虽然后者因难以分离而闻名，但她解释说，即使是已降解的RNA通常也含有足够完整的序列用来进行分析，只要研究人员能够在混杂着其他大量RNA分子的环境中检测到罕见的肿瘤信号。
极低的信噪比给科学家和试剂供应商带来了更多挑战。Bramlett说：“你在干草堆里找这些针，但你经常会发现很多你并不想找的针，比如产品生产过程中的微小变化，或者你选用的对照样品的细微差别。”
大量的质量检测和多样化的市场需求使得好的商品化试剂和对照样品都异常昂贵。Bramlett解释说，生产商首先是致力于提供包含多种对照样品的复合产品，以满足尽可能多种类型的液体活检需求。 而聚焦于少数肿瘤标志物的研究人员则不得不为那些他们并不需要的对照样品买单。最近，赛默飞世尔科技公司开始开发更具针对性的复合产品，希望可以帮助研究人员进行性价比更高的液体活检。
然而，在实验开始之前，实验室需要为样本收集和处理拟定合理的流程。Bramlett说：“很多时候，人们都低估了这些步骤的重要性。在你开始研究之前，应该把所有这些都考虑进去，确保你有一个好的样本，可以用于评估你的液体样品。”
考虑到处理循环系统游离DNA和RNA片段的难度，许多研究人员在液体活检中寻找其他东西进行分析也就不足为奇了。这一领域的另外两个主要目标，即循环肿瘤细胞和外泌体，它们也面临着各自的挑战。
Michael Kazinski是位于德国希尔登的凯杰公司（Qiagen）的样本准备技术全球产品管理高级总监兼负责人，他说：“循环肿瘤细胞的优势在于它们是完整的活细胞。”从这些细胞中分离出的基因组DNA和RNA使研究人员能够从液体活检中获得完整的转录谱。这反过来又会帮助我们获得对肿瘤生物学的深入了解，至少在理论上是如此。
但研究人员长期以来一直认为，肿瘤直到病情较晚时才会将完整的细胞释放到血液中，而且是以极小的数量释放出来。因此，如果想要成功地完成一项检测，需要分离出足够的此类稀有细胞，从而对肿瘤做出统计学上的有效诊断。而这通常是在肿瘤快速生长和变化的阶段。最新的研究表明，这些循环肿瘤细胞可能出现得更早，但要找到它们，仍旧需要极其灵敏的检验方法。
第三种方法，同时也是最新的液体活检方法叫做体外筛选，这种方法依赖于循环的亚细胞囊泡。Kazinski解释说这些被称为“外泌体”的小囊泡实际上是从体内的每个活细胞中释放出来的。 它们具有天然功能，但也可作为RNA的保存容器，除信使RNA外，微泡还含有微小RNA和蛋白质，提供有关其亲本细胞的转录和调节环境的信息。
不管研究人员采用何种方法， Kazinski都再三强调谨慎处理样本的重要性，他说：“被严重低估的是细节问题的影响：如何抽血，如何储存甚至运输它？”凯杰公司推出了一系列经过特殊处理的血液采集系统，可对化学特征稳定的样本进行灵敏的液体活检。
随波逐“流”
对于研究循环肿瘤细胞的人来说，采样后的下一步是尽可能快速且温和地分离出所需的细胞。许多肿瘤细胞的表面上有独特的抗原，而利用亲和力技术可以很容易地将这些细胞从血液样品中分离出来。事实上，这是在第一个获得美国食品和药物管理局（FDA）批准的液体活检试验CellSearch的基础上，由强生公司的子公司Veridex开发的检测方法。该测试技术专利现已由加州圣迭戈的Menarini Silicon生物系统公司掌握。
不幸的是，CellSearch也成为了液体活检开发人员的一个警示。2008年，美国食品和药物管理局批准了一项测定乳腺癌、前列腺癌和结肠癌预后的试验。当随后的研究发现CellSearch的检测对临床结果没有什么影响时，保险公司就失去了继续掏钱的兴趣。
尽管许多研究人员仍在开发基于亲和力的技术来分离循环肿瘤细胞，但也有一些人正在利用正常细胞和肿瘤细胞之间的物理差异来进行分离研究。加州门罗公园Vortex Biosciences公司的研发副总裁Elodie Sollier-Christen说：“当你走在河边，会看到河中的漩涡将树叶和树枝困住，我们用的是完全相同的流动现象，只是规模要小得多。”
涡旋系统利用微流控芯片产生微小的涡旋，从血浆样本中捕获体积更大、形变更严重的癌细胞。芯片本身是一次性的，系统是完全自动化的。用户只需从病人身上采集血液样本，将其输入设备，并在几个小时后取回已经纯化的肿瘤细胞即可。Sollier-Christen说：“这些细胞没有被束缚或挤压，所以它们在流动过程中保持完整，然后研究人员可以把循环肿瘤细胞拿到他们想要用的各种平台上进行化验。”虽然涡旋系统是专门为血液设计的，但该公司正与学术界的研究人员合作，开发出可以将细胞从其他体液中分离出来的方法，比如脑脊液和尿液。
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