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作者：Kendall Powell/ 文 李楠 / 译 来源： 发布时间：2018-4-10 12:51:41
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Madeline Lancaster曾是研究人类大脑发育和小脑畸形发病根源的博士后，她和她的实验室研究人员面临着类似的问题。例如，小鼠大脑并不像一个微型人脑一样运转和发育，而大脑内复杂的层级网络也并不是由那些在实验室培养皿底部生长的神经干细胞进化产生的。
她真正需要的，是一个可以在实验室中培养和调控的小型器官。在2013年，Lancaster开发了一种技术来实现这个目标：她从人类诱导多能干细胞（IPS）中培育出了脑瀑样组织[1]。这项技术的关键是选择神经干细胞，并将其植入一种由多种蛋白质组成的凝胶中，这些蛋白质通常是在细胞周围的强化区和滋养区中发现的。通过仿造这个被称为“细胞外基质”（ECM）的区域，可以培养干细胞在3D空间中生长。这些细胞自发地发育成与煮熟的蛋清相似的小型大脑，同时具有了胚胎人类大脑的特定分层和组织特征。
Lancaster目前在位于英国剑桥的医学研究委员会分子生物学实验室（Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology）工作，是一个科研团队的负责人，她介绍说他们正在为细胞提供3D培养的基质，从而激发他们的自组装本能。她的小组进一步简化了该流程，用她的话说就是 “在任何标准的组织培养实验室中都能产生脑瀑样组织” 。
通常为了进行科学研究，实验室中的传统2D细胞培养方法往往依赖于永生化的肿瘤细胞系，但是这些细胞系的使用会伴随一些比较严重的问题，即在实验室中通过多年的传代而积累的突变和来自其他细胞类型的污染。此外在平整坚硬的塑料培养皿中培养得到的细胞常常还会表现的很奇怪，比如最大程度的偏平化拉伸生长。
新泽西纽瓦克有一家专门研究3D细胞培养试剂的生物科技公司，叫做TheWell Bioscience。他们公司的总裁兼首席执行官John Huang表示：“许多备选药物在2D培养中已经取得了成功，因为细胞形态是平的，故而容易受到药物的攻击。但一旦它们进入动物体内，药物就会失效，因为2D和3D环境中的作用机理是不一样的。”他同时还表示，许多细胞生物学家想要的是可以对各种各样的患者细胞（健康细胞和疾病细胞）进行培养的方法，并且使它们可以像在体内原位一样生长，甚至形成多层和多细胞组织。
当然，3D细胞培养也并非没有挑战。在科罗拉多大学波德分校（University of Colorado Boulder）工作的生物工程师Kristi Anseth是一个研究小组的负责人，她表示：“当你将细胞放入3D环境中时，很难对它们进行成像或免疫染色来查看某些蛋白质是否存在，也很难在培养它们后重新捕获这些细胞。”
但是Anseth自己和整个领域同行的直觉告诉她，3D培养对生物学更有意义，因为我们身体中的绝大多数细胞都是这样生长的。目前许多公司也已经涉足该领域，目的就是为了使3D细胞培养以及下游的细胞成像和检测更加简便。
关注细胞支架
任何方式的3D细胞培养的第一步都是把细胞从硬塑料上取下来，放到更舒适的地方。Matrigel被称作3D细胞基质中的“贵妇”，它是30多年前由美国国家卫生研究院（NIH）的内部研发人员开发的动物源性基质，开始用于3D细胞培养和肿瘤细胞入侵研究，后来被Corning公司商业化。它来自富含ECM蛋白质（如层粘连蛋白，胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖和许多生长因子）的小鼠肉瘤。如此丰富的ECM蛋白质对研究人员来说是一种馈赠，Lancaster的神经干细胞在这个支架上生长时就感觉宾至如归。但是由于在实验中引入了未知的生物成分，也成为了一种限制。同时，Matrigel也必须依靠冷藏来保持液态，在10℃时就会开始形成凝胶，所以实验过程都要求在冷室中进行。
位于马萨诸塞州波士顿的Corning Life Sciences公司的副总裁兼总经理Richard Eglen表示，在Matrigel中加入合适的生长因子后，许多细胞茁壮成长，例如肝细胞可以发育成肝脏瀑样组织。Eglen说：“Matrigel几乎领先于那个时代，在很多情况下，你会得到正确分化的细胞，它们就像在体内一样开始自我组织。”
TheWell Bioscience公司提供了一种比Matrigel更易于使用的极简版水凝胶。非动物来源的多糖VitroGel 3D在室温下是稳定的，只有添加了含有钙或钠离子的培养基时，才开始聚合成凝胶。Huang说典型的水凝胶只需要10~15分钟就能形成，混合步骤也十分简单。
VitroGel 3D可作为一种柔软的2D涂层，亦可用作嵌入细胞的3D基质，或作为动物研究的注射剂。它的二代产品叫做VitroGel 3D-RGD，含有可以与大多数粘附性细胞的表面结合的位点。Huang介绍说，让研究人员知道VitroGel 3D不含任何不必要的生物成分是一个额外的卖点。研究人员可以调整培养基的成分来构建一种水凝胶，这种水凝胶可以包含他们想要的任何配体或生长因子，以影响其中的细胞。
位于瑞士巴塞尔的Lonza Bioscience Solutions公司的Lubna Hussain是负责原代细胞和3D细胞培养产品的高级产品经理，他建议研究人员“要知道你的最终目标是什么，并且在3D细胞培养工作中使用逆向思维。”Lonza的RAFT（Real Architecture For 3D Tissue）3D细胞培养系统包含了大鼠胶原蛋白，这些胶原蛋白是在凝胶过程中支撑细胞的介质，同时以24或96孔吸收剂来浓缩胶原蛋白。将细胞与胶原蛋白和胶凝剂混合后，置于培养基顶部的吸收剂会吸收过量的胶原蛋白。最终的结果是形成一个嵌有细胞的“隐形眼镜状结构”，这一过程大约需要一个小时的时间来完成。Hussain说RAFT系统创造了一个高密度的环境，即每毫升体积内的胶原蛋白高达80毫克，这更接近于体内细胞周围的ECM环境。
RAFT系统允许研究人员建立各种类型的培养方法，将细胞嵌入基质中，在凝胶基质的顶部分层进行侵袭实验，或两者兼而有之。研究人员可以通过插入工具来建立包含气液界面的3D细胞培养模型，例如皮肤或呼吸道上皮细胞。Hussain介绍说研究人员已经开始创造性地建立共培养模式来将癌细胞嵌入到一个薄片中，然后将免疫细胞分层排列在薄片上，以研究它们是如何渗透到肿瘤内的。
几何结构意义重大
有时候研究人员会希望细胞在3D环境中生长，同时仍兼具在液体中培养细胞时的便利性。微载体的出现使得这个问题得以改善，可以做到两全其美。Global Cell Solutions是一家提供3D细胞培养工具和细胞检测方法的公司，该公司利用全局性真核细胞微载体（GEM）系统在直径75到150微米的藻酸盐磁珠表面进行高密度细胞培养。这些光学透明的球体可以像水一样进行抽取而且内部含有铁磁颗粒，以便于磁吸悬浮或在试管中收集。弗吉尼亚Charlottesville公司的联合总裁Robin A. Felder解释说，这些小珠上涂有“五种仿生涂层”，即纤连蛋白，明胶，胶原蛋白，Matrigel和聚赖氨酸等。
Felder说，GEM浆液“既提供了细胞悬浮培养所具有的各种优势，也会使细胞在仿生多孔表面进行定向生长”。这意味着，在GEM中生长的细胞与2D中生长的细胞不同，它们可以表现出在体内才会看到的表面特征，例如人肾细胞上的大量微绒毛。Felder表示:“细胞喜欢湿软弯曲的表面，这样它们就不会觉得自己和身体表面分开了。”
此外，Felder还指出，GEM上生长的细胞在用于观察2D培养细胞的传统成像系统中很容易操作，包括电子显微镜和荧光共焦显微镜。3D磁珠为观察细胞的侧面提供了罕见的视角，通常在2D平面培养中细胞的这个面是很难看到的。而且增加的GEM表面积允许在拥塞的50毫升管中培养多得多的细胞。Felder同时补充道，Global Cell Solutions正在开发一个机器人系统，可以自动进行32个独立的GEM细胞培养皿的护理和营养供给。
一个无须凝胶的体系
通常在进行其他检测之前，要先把在基质、凝胶或凝胶微载体上生长的细胞分离出来。这需要完全或部分溶解细胞支架，或用酶解方法将细胞剥离出来——所有的过程都可能会以某种意想不到的方式干扰细胞的生长。很多时候，研究人员希望看到他们想要的细胞在没有支架干扰的情况下，在3D空间中生长时的表现是怎样的。无支架技术带来的好处是不引入任何物理或者化学上可能影响细胞的东西。但直到最近，无支架的3D培育技术还很棘手，而且稳定性较差。
在无支架的3D细胞培养中，细胞与相邻的细胞相互连接，开始形成自己的原生ECM，并形成一个细胞球。一种主流的方法是利用重力和细胞培养基上的“悬滴”。另一种诱导细胞形成球体的方法是把它们铺在特殊的“超低附着”培养皿中。现在，技术的革新使得培育细胞球的方法较之以前变得更简单、更稳定、更安全，从而不再有包含珍贵细胞的悬滴丢失。
Corning的细胞球微孔板在96孔板和384孔板中提供超低附着表面和U形孔底。在自动成像的过程中，黑边透明底的微孔板可以确保细胞球的位置和尺寸的重现性。
Timothy Spicer表示说，Corning孔板的使用，使得他们更加有可能在3D培养细胞上进行高通量筛选（HTS）以发现新药。Timothy Spicer是佛罗里达州朱庇特斯克里普斯研究所（The Scripps Research Institute）的先导化合物鉴定（ID）部门工作，他负责管理探索生物学及高通量筛选平台，这是一个向所有斯克里普斯研究所研究人员和外部合作者开放的公共技术平台。
Spicer一直在与Corning公司合作完善1536孔细胞球微孔板的原型，这是最便于进行自动化高通量筛选的方式，可以实现小型化，而且节约成本。在一项使用HT-29结肠癌细胞系的研究中，Corning和Scripps的研究人员通过利用一个包含3300多种已知药物分子文库进行筛选，直接对比了在2D环境中生长的细胞和生长成球状的细胞团。3D筛选中展现出效果的药物远远少于2D筛选，这意味着在3D培养中只有很少的药物可以产生与2D培养中同样的细胞毒性水平[2]。
Spicer说：“在不远的未来，我们可以取出源自患者的肿瘤细胞，将它们放入这些细胞球微孔板中，通过培育观察并进行化合物库筛选。在几天之内，就能找到对杀死癌细胞最有效的药物。
同样是在细胞球微孔板市场上竞争，瑞士苏黎世的3D微组织公司InSphero拥有一套双板系统，该系统可以实现自动化操作，使悬滴培养的细胞转变为微型组织。该公司的全球营销总监Randy Strube表示，细胞模型越复杂，悬滴系统就越适合它。在这种系统中，重力和自组装会驱使微组织在富氧环境中形成。
InSphero的GravityPLUS培养板使悬滴变得简单稳定，并且很方便在96孔格式中进行转移。通过在每个微孔内设置一个独特的沙漏型通道，平板可以保持悬滴的稳定，而且可以从外界移入培养基或更多的细胞。一旦细胞球或3D微组织形成，就可以很容易地把它们转移到匹配的GravityTRAP型96孔板内。GravityTRAP是细胞球培养板，具有圆锥形平底孔和保证移液时不扰动细胞球的专用凸台。该装置使得研究人员能够以一种可重复且小型化的方式，生产出无支架的复杂微组织。
更多的维度
对于那些不想花几个月时间开发自己的3D培养系统的科研人员来说，InSphero还为药物研发人员提供了已经预先验证和检测的微组织。InSphero目前生产多种不同类型的微组织，主要集中在毒理学研究用的肝脏模型，糖尿病研究用的胰岛，以及用于肿瘤研究的肿瘤—基质共培养微组织。
无独有偶，Hussain介绍说，Lonza的人类原代细胞将科研人员的大量时间精力从提取患者样品并从头进行细胞培养中解放出来，可以为他们节省平均6个月的时间。她同时也补充道，研究人员仅需从21种细胞类型家族中的一个中得到冷冻保存或新鲜的细胞，就可以轻松地开始进行科研工作。
Anseth表示， 3D培养的最终目标并不只是精确地再现人体的复杂性。为了解释这一点，她利用飞行作为类比：“飞机会飞，并不是因为它们看起来像鸟，而是因为我们对飞行的机制了解得够多。”她的观点是，对3D环境下细胞系统或生命过程“足够”了解，就有可能在生命过程出错或促进康复的过程中进行适当的干预。
众多公司目前正致力于器官芯片或人体芯片的设计应用，这一技术可以让研究者在实验室里用小型化的仪器对不同组织之间的交流进行捕获和调控，这预示着3D培养的下一场科技浪潮已经悄然来袭。研究3D结构随着时间或不同的生长因子增减过程的生长和改变（也被称为“4D细胞培养”），将会带来可能加速康复或打破退行性进程的新发现。
Hussain说，研究人员对3D细胞培养技术的选择就像在杂货店里挑选麦片一样，口味不同，选择自然不同。她建议研究人员首先从他们想要回答的问题开始，然后逆向思考，以选择最合适的技术。就像她说的：“问题是，你使用3D培育技术的具体应用和目标是什么?”■
引用文献：
[1] Lancaster, M. A. et al., Nature 501, 373~379 （2013）.
[2]Madoux, F. et al., SLAS Discovery （2017）， doi: 10.1177/ 2472555216686308.
（译者李楠是万博体育官网-中国足彩网￥app平台:深圳先进技术研究院副研究员。）
Kendall Powell是美国科罗拉多州拉法叶的自由撰稿作者。
DOI: 10.1126/science.opms.p1700114
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2017年4月24日《科学》杂志”。官方英文版请见http://www.sciencemag.org/features/2017/04/adding-depth-cell-culture。
《科学新闻》 (科学新闻2018年3月刊 科学·生命)
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