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作者：Amber Dance /文 李楠/译 来源： 发布时间：2019-3-5 21:13:22
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在短短20小时内，斑马鱼胚胎就从一个单细胞发育成一个拥有2万个细胞能够扭动尾巴的生物体。自从Philipp Keller在2005年开始读博士时，他就想看看在如此之短的时间内这一复杂的过程是怎样实现的。由于胚胎细胞以每秒几微米的速度移动，他需要高速视频来捕捉这一过程。
Keller说，激光片层扫描显微镜是解决这个问题的必要手段。他现在是位于弗吉尼亚州阿什伯恩附近的Janelia 科研园区的一名生物学和物理学专家。即使内部光学系统并非完全如此，激光片层扫描显微镜的概念其实很简单，即一次照亮样品的某个平面，拍摄宽场图像，然后移动平面。这种方法比典型的共聚焦显微镜逐点扫描快得多。与其他技术相比，它对单个细胞造成的光毒性更小。因此，对于很多对高速细胞活动(如神经元的放电或血细胞的流动)感兴趣的科研人员来说，激光片层扫描系统已经带来活细胞成像的下一波浪潮。其他推动活细胞成像发展的技术还包括多光子显微镜和以拉曼显微镜和三倍频成像为代表的无标记成像方式。
“活细胞成像一直都是显微镜的终极用途。”位于德国耶拿的蔡司显微镜公司的应用技术专员Christian Hellriegel这样说。他继续解释，活细胞成像超越了生命的结构，而观察生命的过程，包括细胞或分子如何移动，细胞如何对环境或邻居作出反应，以及大脑如何运作或损伤如何愈合。
公司和科研人员们正在开发一系列的工具，所有这些选择可以归结为以下三种，纽约州伊萨卡的康奈尔大学的应用物理学专家Chris Xu说。“每个人都想看得更深、更快、更宽。”
更深：多光子成像
为了在显微镜下看得更深，一个解决方案是多光子成像，位于英国剑桥的徕卡微系统公司的首席科学官Julian Burke说。徕卡刚刚推出了SP8 DIVE显微镜，这是一个多色双光子系统，可以深入观察活体组织。诀窍是，它不再是用一个光子，而是用两个长波长光子来激发荧光团。Burke说，在最理想的条件下，这些更红、更长的光波可以穿透深达500微米的组织，因为它们不太容易被组织本身散射。它们的光毒性也更低，而且不容易令荧光团淬灭，他补充说。
法国勃艮第大学的化学专家David Monchaud因为多光子成像的精度、灵敏度和活细胞成像能力而被吸引。他研究DNA和RNA四联体，这两种核酸结构最初是通过共聚焦显微镜在固定的死细胞中观察到的。利用多光子显微镜，他可以确认活细胞中存在四联体，这表明它们可能在那里发挥某种功能。“这种显微镜是无价的，” Monchaud说。
如果两个光子很好，那三个光子会不会更好呢？这是Xu正在研究的问题。通过利用三个波长很长的光子来激活一个荧光团，他可以更深入地观察活体样本。在2017年，他报道了对1毫米深处老鼠神经元放电的可视化。Xu说，这种显微镜可以直接通过密集的光散射白质成像，这是以前的显微镜无法做到的。他说，一些实验室正在利用这项技术研究细胞迁移和神经科学等课题。
更快：激光片层扫描技术
然而，多光子成像仍然依赖于速度较慢的逐点扫描。Xu说：“速度和深度总是需要平衡的。” Keller想要在60~90秒内扫描整个斑马鱼胚胎，所以激光片层扫描显微镜就成为了问题的解决方案。
尽管激光片层扫描显微镜是一个古老的概念，蔡司显微镜公司的研究人员在1903年就首次提出了这个概念。但直到这个世纪，这些用于处理图像体积的荧光标签才开始汇聚在一起，使激光片层扫描技术成为主流。蔡司Z.1型激光片层扫描显微镜包括一个悬挂在物镜前的培养槽，里面可以容纳整个生物体（例如一只果蝇甚至是一只小章鱼），而且可以方便地旋转以获得更好的视角。
Keller在2008年发明了一种被称为数字扫描激光片层荧光显微镜（DSLM）的系统，使他得到了梦寐以求的速度：每分钟15亿体素。这个系统的设计不同于常规的商业化显微镜。Kelle将激光和物镜以正确的角度放在台子上；然后，他将斑马鱼胚胎植入琼脂糖中，并将琼脂糖置于光源和物镜之间的试管中。他通过在激光片层中前后移动样品，从而扫描所有平面。他观察到了以前从未见过的斑马鱼胚胎发育和胚层形成的实例。
从那时起，Keller革新了这项技术。另一个问题是，如果样品很大或不透明，激光片层可能无法穿透它。为了解决这个问题，Keller开发了SiMView。他将激光片层和相机加倍，在20毫秒或更短的时间内，即可收集4张图像，因为每个相机可以快速连续地聚焦在两张图像上。
他解决的另一个问题是各向异性，即一个目标在横向xy方向的分辨率通常比在轴向z方向的分辨率高。为了获得在任意视角下具有相同分辨率的3D图像，keller将相机和激光片层的数量再次翻倍至4个，并将这些图像进行数字组合，形成一种名为isoview的技术。
在马里兰州巴尔的摩的国家生物医学成像和生物工程研究所，显微镜专家Hari Shroff也对神经发育科学感兴趣。他与来自康涅狄格州纽黑文的耶鲁大学和纽约的斯隆—凯特琳研究所的科研人员合作，正在对线虫大脑的发育过程进行成像。
“这些蠕虫胚胎很难成像，而且对光线非常敏感，”Shroff说。“你真的必须要快。”
他和他的同事们想要避免经典的激光片层操作。在那种操作中，样品被嵌入一管琼脂糖，并被激光和照相机包围。相反，他们更喜欢把蠕虫胚胎放在标准的盖玻片上。
为了保证入射的激光片层和物镜之间的角度刚好合适，Shroff的解决方案是从垂直方向各倾斜45度。这个设备看起来很像一个标准显微镜，除了载物台上那两个倾斜的物镜。样品保持静止，来自两个不同物镜的激光片层连续移动。该系统被称为反向选择平面照明显微镜（iSPIM）。
和Keller一样，Shroff也处理� |
